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化學發(fā)光丨最具潛力的免疫學檢測方法

日期:2020-10-07

化學發(fā)光丨最具潛力的免疫學檢測方法

免疫學的檢測方法是實驗室使用最普遍的檢測方法，從凝集試驗、膠體金到ELISA，未來隨著檢測方法朝著高通量和自動化的方向發(fā)展，化學發(fā)光方法將是大勢所趨！
概要：化學發(fā)光技術(shù)壁壘高的根本原因在于：1）被檢測物質(zhì)的濃度低（μg/L—pg/L ），造成對整個檢測系統(tǒng)的精密度要求高，儀器與試劑體系封閉；2）整個檢測過程步驟多，自動化難度大；3）包含生物、化學、物理、光學等各個學科的多種前沿技術(shù)，缺一不可。
國內(nèi)外主流的試劑技術(shù)類似，主流有直接化學發(fā)光（異魯米諾（新產(chǎn)業(yè)）、吖啶酯（雅培））、間接（酶促）化學發(fā)光（丹納赫、邁瑞、安圖）、電化學（羅氏），各有優(yōu)劣勢，暫無明顯技術(shù)替代的趨勢，但是電化學發(fā)光被認為是第三代技術(shù)，技術(shù)上略略領先。
試劑的性能包括準確度、靈敏度、線性范圍、抗干擾能力、存儲穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、試劑盒規(guī)格等；機器的性能包含檢測速度、試劑位、樣本位、儀器大小等，準確度是核心，通過與已獲證產(chǎn)品的對比得到；其他性能間接影響準確度，需要結(jié)合具體項目標準、廠家性能以及客戶需求綜合評價。
化學發(fā)光是干什么的？化學發(fā)光臨床廣泛應用于臨床。化學發(fā)光是免疫診斷的一種，是利用抗原抗體之間的特異性反應來測定體內(nèi)疾病標志物濃度，從而判斷人體身體狀態(tài)的診斷方法，廣泛應用于傳染病、心臟疾病、腫瘤、妊娠檢測等。

免疫檢測標志物統(tǒng)計超過100個，按照免疫反應中的角色，標志物可以分為抗體與抗原，其中抗原又包括大分子抗原與小分子抗原。

化學發(fā)光的原理免疫反應。抗原進入機體，刺激機體的免疫系統(tǒng)，使之產(chǎn)生免疫應答，這種反應叫免疫反應。免疫反應應答包括對抗原物質(zhì)的感應、反應、效應三個連續(xù)的階段。免疫分析（immunoassay，IA）。在臨床檢驗中，基于抗原與其配對抗體能夠發(fā)生特異反應，用已知的抗原或抗體檢測分析體液中的抗體或抗原性物質(zhì)。高特異性。抗原抗體的結(jié)合實質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點之間。由于兩者在化學結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補關(guān)系，所以抗原抗體反應具有高度的特異性。抗原抗體反應的高特異性是免疫學檢測的基礎。高親和性。抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應式為：Ag+Ab→Ag·Ab。高親和力抗體的抗原結(jié)合點與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。
免疫分析技術(shù)的發(fā)展：美國臨床化學會議規(guī)定：凡是通過測量光子計數(shù)的方法都是化學發(fā)光。與酶聯(lián)免疫相比化學發(fā)光的進步點：1.全程自動化——機械與自動化；2.定量技術(shù)的優(yōu)化：利用化學發(fā)光發(fā)光，精確計算光子數(shù)——光學；3.磁性顆粒的應用——材料；4.抗體標記技術(shù)的進步——生物化學。

免疫診斷五大方法對比：化學發(fā)光是趨勢與其他免疫診斷方法相比，化學發(fā)光由于其在安全性、自動化操作、測試準確性、以及測試速度等方面的系統(tǒng)性優(yōu)勢，在性能上對其他技術(shù)形成全面超越，因此成為免疫診斷的主流。

化學發(fā)光步驟繁多。化學發(fā)光原理解析：以酶促法（一步法）為例

根據(jù)沖洗次數(shù)，可以分為一步法、兩步法、三步法等、四步法；
各個組分的量在5~200uL級別；所有過程均需要在特定溫度中進行；樣本中與被檢測檢測抗原/抗體結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)會對結(jié)果產(chǎn)生較大影響；

磁微粒標記-分離技術(shù)

?磁微粒指的是nm級別的磁性顆粒，表面帶有活性基團；

磁微粒可以利用表面的活性基團與抗體、抗原、鏈霉親和素連接；

伴隨著磁微粒技術(shù)的發(fā)展，板式發(fā)光已基本被替代。

磁微粒分離技術(shù)特點：

?較微孔板擴大抗原抗體結(jié)合表面積，增加抗原或抗體的結(jié)合量，提高檢測靈敏度。

?加快反應速度，迅速捕獲抗原抗體。

?易于結(jié)合相、游離相的分離，提高檢測準確性

酶標記技術(shù)、溯源以及試劑盒的開發(fā)難點酶標記技術(shù)?抗體/抗原表面具有多個活化基團（氨基/羧基），通過這些基團連接酶與抗體稱為酶標記；?酶標記分為大分子與大分子標記、大分子與小分子標記；?交聯(lián)程度的小大對試劑盒性能起重要影響。試劑盒的開發(fā)?變量多：抗體對的配對、“磁珠”與“酶標”的稀釋度、合適的“配方”溶液、其他的試劑盒組分、孵育時間檢測結(jié)果溯源?將開發(fā)的試劑盒檢測結(jié)果與對照結(jié)果建立相關(guān)的關(guān)系?標準品的穩(wěn)定性是難點?不同的廠家檢測結(jié)果的絕對值可能不同

主流的化學發(fā)光技術(shù)各有千秋化學發(fā)光的基本原理：由于化學反應（通常是氧化）底物從基態(tài)躍遷為激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，躍遷能量以光子形式釋放的現(xiàn)象。

吖啶酯、ALP以及HRP發(fā)光系統(tǒng)的原理

電化學發(fā)光原理

各個系統(tǒng)優(yōu)劣勢比較

主流的5大發(fā)光技術(shù)各有優(yōu)缺點??綜合來看，主流的5大發(fā)光技術(shù)各有優(yōu)缺點，不能說技術(shù)誰優(yōu)誰劣，但是從市場來看，Roche的電化學發(fā)光技術(shù)市場認可度稍稍領先；?從國外四大家的優(yōu)勢項目對比來看，Roche（電化學）在腫瘤項目上占優(yōu)，雅培（吖啶酯）在傳染病項目上占優(yōu)，而丹納赫（ALP）在甲功激素項目上占優(yōu)，也可以看出代表各個國外龍頭廠家代表的技術(shù)無法占據(jù)絕對優(yōu)勢；?相對于不同技術(shù)種類的差異，國內(nèi)廠家對產(chǎn)品研發(fā)、質(zhì)量控制能力更為重要。
化學發(fā)光試劑的性能評價與比較：?準確度是評價試劑性能的主要指標，一切指標都體現(xiàn)在測試是否準確，但是由于各個標志物均有一定的特異性，客戶無法根據(jù)某一次結(jié)果的正確與否對該廠家的產(chǎn)品做出評價——化學發(fā)光的結(jié)果只能作為參考，不能作為金標準；?國內(nèi)廠家結(jié)果的準確度根據(jù)與國外廠家的對比結(jié)果來判斷，線性系數(shù)R2、顯著性水平等是重要的指標；?除了準確度以外，試劑的靈敏度、重復性、線性范圍、抗干擾能力、存儲穩(wěn)定性、開機穩(wěn)定性、試劑盒的包裝量等20多個參數(shù)均為試劑盒的評價指標。除了儀器與試劑性能的對比，裝機量、單機使用量、項目總數(shù)量、項目發(fā)布、三甲醫(yī)院使用率等數(shù)據(jù)對評價廠家的產(chǎn)品同樣重要，需要綜合評價。

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